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Ames试验步骤 GB 15193.4—1994

 【GB 15193.4—1994】
鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验

  1 主题内容与适用范围
  本标准规定了Ames试验的基本技术要求。
  本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。
  2 原理
  鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长,在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时,则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型),因而在无组氨酸培养基上也能生长,故可根据菌落形成数量,检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变,代谢活化系统可以用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆(S-9)制备的S-9混合液。
  3 仪器
  3.1 实验室常用设备。
  3.2 低温高速离心机,低温冰箱(-80℃)或液氮罐,洁净工作台,恒温培养箱,恒温水浴,蒸气压力锅,匀浆器等。
  4 培养基制备及试剂的配制
  培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯,无诱变性。避免重复高温处理,选择适当保存温度和期限,如肉汤保存于4℃不超过六个月,其他详见下述各培养基及溶液说明。
  4.1 营养肉汤培养基
  牛肉膏        2.5g
  胰胨(或混合蛋白胨) 5.0g
  氯化钠        2.5g
  磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)1.3g
  蒸馏水        500mL
  加热溶解,调PH至7.4,分装后0.103MPa20min灭菌,普通冰箱保存备用,保存期不超过半年。
  4.2 营养肉汤琼脂培养基:用作a.基因型鉴定的结晶紫敏感试验,抗氨节青霉素和四环素试验,紫外线敏感性试验。b.细菌活力鉴定。
  琼脂粉        1.5g
  营养肉汤培养基    100mL
  加热融化后调pH为7.4,0.103MPa 20 min灭菌。
  4.3 底层培养基所需试剂及配制方法如下:
  4.3.1 磷酸盐贮备液
  磷酸氢钠铵(NaNH4HPO4·4H2O)         17.5g
  柠檬酸(C6H8O7·H2O)             10.0g
  磷酸氢二钾(K2HPO4)              50.0g
  硫酸镁1)(MgSO4·7H2O)            1.0g
  加蒸馏水至100mL,0.103MPa 20min灭菌。
  注:1)待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解,否则易析出沉淀。
  4.3.2 40%葡萄糖溶液
  葡萄糖     40.0g
  加蒸馏水至 100mL,0.055MPa 20min灭菌。
  4.3.3 1.5%琼脂培养基
  琼脂粉      6.0g
  蒸馏水      400mL
  融化后0.103MPa 20min灭菌。
  4.3.4 底层培养基(无菌操作)
  趁热(80℃),在灭菌琼脂培养基中(400mL)依次加入:
  磷酸盐贮备液    8mL
  40%葡萄糖溶液    20mL
  充分混匀,待凉至80℃左右时倒平皿,每皿(φ90mm)25mL,37℃培养过夜以除去水分及检查有无污染。
  4.4 顶层培养基的成分及制备
  4.4.1 顶层琼脂
  琼脂粉   3.0g
  氯化钠   2.5g
  加蒸馏水至 500mL
  4.4.2 0.5mmol以L组氨酸-生物素溶液(诱变试验用)
  D-生物素(分子量244)   30.5mg
  L-组氨酸(分子量155)   17.4mg
  加蒸馏水至250mL。
  4.4.3 顶层培养基制备:加热融化顶层琼脂,每100mL顶层琼脂中加10mL 10.5mol/L组氨酸-生物素溶液。混匀,分装在100mL三角瓶中,0.103MPa 20min灭菌。用时融化分装小试管,每管2mL,在45℃水浴中保温。
  4.5 特殊试剂和培养基的配制
  4.5.1 0.8%氨节青霉素溶液(鉴定菌株用,无菌配制)
  称取氨节青霉素40mg,用0.02mol/L氢氧化钠溶液稀释至5mL,保存干冰箱。
  4.5.2 0.1%结晶紫溶液(鉴定菌株用)
  称取100mg结晶紫,溶于100mL无菌水。
  4.5.3  L-组氨酸溶液和0.5mol/L D-生物素溶液(鉴定菌株用)
  称取L-组氨酸0.4043g和D-生物素12.2mg,分别溶于100mL蒸馏水,0.103MPa 20min灭菌,保存于4℃冰箱。
  4.5.4 0.8%四环素溶液(用于四环素抗性试验和氨节青霉素-四环素平板)
  称取40mg四环素,用0.02mol/L盐酸稀释至5mL,保存于4℃冰箱。
  4.5.5 氨节青霉素平板(用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板)和氨节青霉素-四环素平板(用作TA102菌株的主平板)每1000mL中由以下成分组成:
  底层培养基          910mL
  磷酸盐贮备液         20mL
  40%葡萄糖溶液         50mL
  组氨酸水溶液(0.4043g/100mL)  10mL
  0.5mol/L生物素        6mL
  0.8%氨节青霉素溶液      3.15mL
  0.8%四环素溶液        0.25mL
  四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。
  4.5.6 组氨酸-生物素平板(组氨酸需要试验用)每1000mL中由以下成分组成:
  底层培养基          914mL
  磷酸盐贮备液         20mL
  40%葡萄糖溶液         50mL
  组氨酸水溶液(0.4043g/100mL)  10mL
  0.5mol/L生物素        6mL
  以上成分均已分别灭菌。
  4.5.7 二甲基亚砜:光谱纯,0.103MPa 20min灭菌。
  4.6 S-9辅助因子(混合液试剂)的配制
  4.6.1 0.4mol几氯化镁(MgCl2)溶液:称取3.8g,加蒸馏水稀释至100mL。
  4.6.2 1.65mol/L氯化钾(KCl)溶液:称取12.3g,加蒸馏水稀释至100mL。
  4.6.3 0.2mol磷酸盐缓冲液(PH7.4),每500mL由以下成分组成:
  磷酸氢二钠(Na2HPO4)(14.2g/500mL)440mL
  磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)(13.8g/500mL)60mL
  调PH至7.4,0.103MPa20min灭菌或滤菌。
  4.6.4 辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液:准确称取辅酶-Ⅱ,用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液,低温保存(-20℃以下)。
  4.6.5 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液:称取葡萄糖-6-磷酸钠盐,用无菌蒸馏水溶解配制成0.05mol/L,低温保存(-20℃以下)。
  4.7 10%s-9混合液的配制:每10mL由以下成分组成,临用时配制。
  磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH7.4)     6.0mL
  氯化钾溶液(1.65mol/L)         0.2mL
  氯化镁溶液(0.4mol/L)          0.2mL
  葡萄糖-6-磷酸盐溶液(0.05mol/L)    1.0mL
  辅酶Ⅱ溶液(0.025mol/L)         1.6mL
  肝S-9液                1.0mL
  混匀,置冰浴中待用。
  5 活化系统(S-9和S-9混合液)的制备
  用哺乳动物如大鼠,经诱导剂处理,取肝组织制备匀浆,9000g离心,上清液为S-9组分,与辅助成分以适当比例组成S-9混合液,用作试验中的代谢活化系统。
  5.1 大鼠肝S-9的诱导和制备
  5.1.1 选健康雄性成年5D或Wistar大白鼠,体重150g左右,周龄约5~6周。将多氯联苯(Aro-clor1254或国产PCB-五氯)溶于玉米油中,浓度为200mg/mL,按500mg/kg(体重)无菌操作一次腹腔注射,5d后断头处死动物,取出肝脏称重后,用新鲜冰冷的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加0.1mol/L氯化钾溶液3mL,连同烧杯移入冰浴中,用消毒剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000r/min,往复1~2min),或组织匀浆器(20000r/min,1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
  5.1.2 将制成的肝匀浆在低温(0~4℃)高速离心机上,以9000g离心10min,吸出上清液为S-9组分,分装于无菌冷冻管或安瓿中,每安瓿2mL左右,最好用液氮或干冰速冻后置-80℃低温保存。
  5.1.3 S-9制成后,经无菌检查,蛋白含量测定(Lowry法),每毫升蛋白含量应不超过40mg为宜,因过量蛋白将会抑制回复突变率,并经间接致癌物(诱变剂)鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥,保存期不超过一年。
  5.2 S-9混合液配制
  由S-9液和辅助因子(S-9混合液试剂)组成,辅助因子按Ames(1983的配方,低温(-20℃以下)贮存。混合液临用时新鲜无菌配制,或滤过除菌。一般按1∶9配成10%混合液。用每皿0.5mL S-9混合液(含20~50μL S-9)测定其对已知阳性致癌物(诱变剂)的生物活性,确定最适用量,或者按一般用量,即每平皿0.5mL S-9混合液(含S-9 50μL)。S-9活性和用量应在报告中予以说明。
  6 菌株及其鉴定和保存
  6.1 采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102、。TA97和TA98可检测各种移码型诱变剂;TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂;TA102能检出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂,如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂霉素C等交联剂。一般用来测试受试物诱变性时,必须通过四个菌株的检测。必要时可增加TA1535,TA1537或TA104任一菌株。
  6.2 菌株特性应与Ames试验标准相符(见表A1)。突变型菌的某些特性易丢失或变异,遇到下列情况应鉴定菌株的基因型:a.在收到培养菌株后;b.当制备一套新的冷冻保存株或冰冻干燥菌株时;c.当每皿自发回变数不在正常范围时;d.当对标准诱变剂丧失敏感性时;e.使用主平板传代时;f.投入使用前。鉴定方法如下:
  6.2.1 增菌培养:在5mL营养肉汤培养基中接种贮存菌培养物,于37℃振荡(100次/min)培养10h或静置培养16h备用。
  6.2.2 组氨酸缺陷型的鉴定
  6.2.2.1 加热融化底层培养基两瓶(一瓶不加组氨酸,一瓶加组氨酸),不加组氨酸者每100mL底层培养基中加0.5mg分子D-生物素0.6mL;加组氨酸者每100mL底层培养基中加L-组氨酸(每100mL中含0.4043g)1mL和0.5mg分子D-生物素0.6mL,冷却至50℃左右,各倒两个平皿。
  6.2.2.2 接种:取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个,按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线(直线)接种在培养基表面,37℃培养48h。
  6.2.2.3 结果:四株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜,无组氨酸培养基平皿上除自发回变菌落外无菌膜,说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。
  6.2.3 脂多糖屏障缺陷的鉴定
  6.2.3.1 加热融化营养肉汤琼脂培养基。
  6.2.3.2 接种:取菌液0.1mL移入平皿,迅速将营养肉汤琼脂培养基(冷却至50℃左右)适量倒入平皿,混匀,平放凝固。将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平皿中央,用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液10μL,37℃培养24h,每个菌做一个平皿。
  6.2.3.3 结果:阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带,说明存在rfa(深粗型)突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制带,野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带。
  6.2.4 R因子的鉴定
  6.2.4.1 加热融化营养肉汤琼脂培养基,冷却至50℃左右,适量倒入平皿中,平放凝固,用移液器吸0.8%氨节青霉素10μL,在凝固的培养基表面依中线涂成一条带,待氨节青霉素溶液干后,用接种环与氨节青霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株,并且接种一个不具有R因子的菌株作氨节青霉素抗性的对照(一个平皿可同时鉴定几个菌株),37℃培养24h。
  6.2.4.2 结果:4个菌株经过24h培养,在氨节青霉素带的周围依然生长不受抑制,即有抗氨节青霉素效应,证明它们都带有R因子。
  6.2.5 四环素抗性的鉴定
  6.2.5.1 用移液器各吸取5~10μL0.8%四环素溶液和0.8%氨节青霉素溶液,在营养肉汤琼脂培养基平皿表面依中线涂成一条带,待四环素和氨苄青霉素液干后,用接种环与四环素和氨节青霉素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株(作四环素抗性的对照),37℃培养24h。
  6.2.5.2 结果:TA102菌株生长不受抑制,对照菌株有一段生长抑制区,表明TA102菌株有抗四环素效应。
  6.2.6 uvrB修复缺陷型的鉴定
  6.2.6.1 在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。
  6.2.6.2 接种后的平皿一半用黑纸覆盖,在距15W紫外线灭菌灯33Cm处照射8s,37℃培养24h。
  6.2.6.3 结果:对紫外线敏感的三个菌株(TA97、TA98、TA100)仅在没有照射过的一半生长,具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。
  6.2.7 自发回变率的测定
  6.2.7.1 准备底层培养基平皿8个。
  6.2.7.2 融化顶层培养基8管,每管2mL,在45℃水浴中保温。
  6.2.7.3 在每管顶层培养基中,分别加入待鉴定的测试菌株的菌液0.1mL,一式二份,轻轻摇匀,迅速将此试管的内容物倾入已固化的底层培养基平皿中,转动平皿,使顶层培养基均匀分布,平放固化,37℃培养48h计数菌落数。
  6.2.7.4 结果:每一株的自发回变率应落在表A1所列正常范围内。
  6.3 鉴定合格的菌种应保存在深低温(如-80℃)或加入9%光谱级DMSO作为冷冻保护剂,保存在液氮条件下(-196℃),或者冰冻干燥制成干粉,4℃保存。除液氮条件外,保存期一般不超过2年,主平板贮存在4℃,二个月后丢弃,TA102主平板保存两周应该丢弃。
  7 受试物剂量、溶剂和特殊处理
  7.1 受试物最低剂量为每平皿0.2μg,最高剂量为5mg,或溶解度允许,或饱和浓度,或对细菌产生最小毒性浓度,每种受试物在允许最高剂量下用4个(含4个)以上剂量,每剂量间隔不超过5倍,每个剂量应做三个平皿,否则应说明选定剂量的理由。
  7.2 溶剂可选用水、二甲基亚砜(每皿不超过0.4mL),或其他溶剂(毒性剂量以下)。无论选用什么溶剂均应无诱变性。
  7.3 若遇特殊样品作非常规处理时应在报告中说明。对以下几种情况可作如下处理:
  7.3.1 含组氨酸样品:根据食品中测得的组氨酸含量若能诱发回变率的增高可加设组氨酸平行对照组;或将检品经XAD-Ⅱ树脂柱过滤洗脱预处理。
  7.3.2 食品包装材料及其制品成分:根据材料或制品的组成成分,可分别采取过筛抽提、蒸发残渣等技术处理。
  7.3.3 挥发性样品:可采用真空干燥器处理等方法。
  7.3.4 天然植物材料:可按植物化学方法制备粗制品或纯制品。
  8 方法和步骤
  可分为平板掺入法、预培养平板掺入法及点试法等,分别叙述如下:
  8.1 平板掺入法
  8.1.1 增菌培养:取营养肉汤培养基5mL,加入无菌小三角瓶或无菌试管中,将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内,37℃振荡(100次/min)培养10h至对数增长期,每毫升不少于1~2×109活菌数,培养瓶可用黑纸包裹,以防光线照射细菌。
  8.1.2 底层培养基平皿若干个。
  8.1.3 融化顶层培养基分装于无菌小试管,每管2mL,在45℃水浴中保温。
  8.1.4 在保温的顶层培养基中依次加入测试菌株新鲜增菌液0.1mL,混匀;加受试物0.05~0.2mL(需活化时加10%S-9混合液0.5mL),再混匀,迅速倾入底层培养基上,转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上,平放固化,37℃培养48h观察结果。
  8.1.5 另做一阳性对照和空白对照,不加测试物只加标准诱变剂(见附录A2.2,A2.3)或溶剂,如二甲基亚砜(光谱纯或分析纯),其他方法同上。
  8.2 预培养平板掺入法:预培养对于某些受试物可取得较好效果。因此可根据情况确定,是否进行预培养。在加入顶层琼脂前,先进行以下预培养步骤:在试验中,将受试物(需活化时加入10%s-9混合液)和菌液,在37℃中培养20min,或在30℃中培养30min,然后再加2mL顶层琼脂,其他同上述平板掺入法。
  8.3 点试法
  8.3.1 与掺入法8.1.1相同。
  8.3.2 与掺入法8.1.2相同。
  8.3.3 与掺入法8.1.3相同。
  8.3.4 在水浴中保温的顶层培养基中依次加入测试菌株增菌液0.1mL(需要时加10%S-9混合液0.5mL),混匀,迅速倾入底层培养基上,转动平皿,使顶层培养基在底层上均匀分布。平放固化后取无菌滤纸圆片(直径为6mm),小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上,用移液器取适量受试物(如10μL),点在纸片上,或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面,37℃培养48h观察结果。
  8.3.5 另做阳性对照和空白对照。将加受试物改加标准致突变物(见附录A2.1,A2.3)或溶剂(如二甲基亚砜),其他步骤同上。
  9 结果的判定和报告
  9.1 掺入法的结果判定:以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定,如在背景生长良好条件下,受试回变菌落数增加一倍以上(即回变菌落数等于或大于2乘以空白对照数),并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应,即可认为该受试物为诱变阳性。
  9.2 点试法的判定:如在受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落与空白对照相比有明显区别者,可初步判定该受试物为阳性,但应该用掺入法试验来确证。
  9.3 结果报告:出报告时,阳性结果至少应做三次测试,阴性结果至少进行二次测试,才能对受试物作出判定。受试物的诱变性要用平板掺入试验来确证。报告中应注明实验条件和附上全部结果资料,对结果有疑义者需经统计分析,同一样品必须包括活化和非活化的结果,剂量单位为每平板微克,特殊例外。结果记录和报告格式见附录A3.1和A3.2。
 

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